| Abstract: |
SUMMARYExtermophilic microorganisms have unique ability to live in extreme environments, and deliver valuable source of new biocatalysts and compounds. Exteremophiles and their components are expected to play an important role in many industries as well as envirExtermely halotolerant and thermotolerant microorganisms living in extreme salt and high temperature environments have not yet been used extensively for biotechnological purposes although they posses useful physiological properties, which can facilitate tThe genetic engineering and molecular biology (the study of genes and their function) gained a lot of intention in recent years, has given us strong tools to study the genome of bacterial isolates.The aim of this study was to isolate and purify halotolerant and thermotolerant bacterial isolates from local solar saltren, study unusual characters that are very important in biotechnological applications. Also genetic engineering strategy was used for 1- Soil samples from 4 locations, Mallahat Maryut, Burg El-Arab El-Amiriya and Costal ridge were analyzed for their content of total soluble salts, soluble sulphate and bicarbonate which were found to be 18-24 g/l, 4.1mg/100g and 0.5 mg/100g respectively.2- Nutrient agar medium amended with NaCl concentrations (0.5%, 10%, 15%, 20%, 22% and 24%) and incubated in different temperature (30°C, 55°C and 75°C) was used to isolate and purify the extreme halotolerant and thermotolerant bacteria.3- All the tested samples contained considerable numbers of halotolerant and thermotolerant bacteria. The results showed that, the highest population of bacteria was noticed in sample from Coastal ridge (3.0x105 CFU /g soil DW) in presence of 24% NaCl con4- The most halotolerant isolates were obtained at 30% NaCl (5.2 M) and thermotolerant isolates were obtained at 75°C, according these, ten bacterial isolates were selected for further investigations.5- Colony and Cellular morphology of the bacterial isolates were determined on nutrient agar. The microscopic examination of bacterial isolates revealed that they were gram-positive and producing endospores. Six isolates (group A) were produce insecticida6- the biochemical and the physiological tests were also carried out for all selected isolates which revealed that all bacterial isolates were belonging to Bacillus group which they showed positively gram reaction, facultative aerobic, produced catalase, 7- Random Amplified Polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD-PCR) this analysis was another version of the employing the PCR technology for differentiate between isolates in the same group.8- The total cellular proteins of the sporulated cells were separated on denatured gel by electrophoresis (SDS-PAGE) and the protein bands were visualizes by staining with Coomassie blue –GR 250. The results showed that the protein banding patterns of the9- Protein analysis for group B (4 bacterial isolates supposed to be B. polymyxa) bacterial isolates were detected and compared with 3 strains identified as B. polymyxa. Our isolates agreed in some protein banding pattern with that strains, like protein b10- Salt adaptation may be indicated by a gradually higher accumulation of certain proteins in cells growing under gradually increasing salinities. Our data revealed that at high concentration of salt, protein bands were appeared at ~ 60 kDa and 30 kDa in11- PCR technology and primers specific for B. thuringiensis delta-endotoxin genes to develop a rapid screen of new B. thuringiensis isolates and could predict their insecticidal activities were used. In our work 6 primers were chosen to give characterist12- A set of primers was designed from previously published sequences of gln B gene (the nitrogen regulatory gene) and nif D gene were used with the other 4 isolates that supposed to be B. polymyxa. All the 4 isolates gave the 250 bp product with gln B sp13- Insecticidal activity of the B. thuringiensis isolates was determined against the lepidopteran cotton leaf worm Spodoptera littoralis. One isolate (S1) was convenient and promise when bioassay against neonatal larvae were performed, it displayed LC50 14- Gene technology was used for cloning and expression of carboxy-terminal truncated 2.2 kb DNA fragment of cry1C and the preliminary study showed that it was different from the published cry1C genes, and transferring this gene to the E.coli JM109 using 15- Plasmids DNA from recombinant clones were isolated and analyzed on agarose gel and electrophoresed. The selected clones were subjected to several screening procedures, as detailed in the next confirmatory tests.A- PCR screening of recombinant clones since the expected 2.2 Kb PCR product amplified by reaction of IAF/IAR primers with DNA from clones contained the recombinant plasmid that harbors cry1C.B- Restriction enzymes digestion of recombinant clones (EcoR1 and Not1), restriction enzymes digestion were done for the transformed E.coli plasmid and gave ~ 2.3 Kb for the inserted cry1C and ~ 3.1 Kb for the vector.C- Cellular proteins from the recombinant clones were analysed on SDS-polyacrylamid gel electrophoresis. The results were compared to the protein pattern from free JM109 E.coli (nontransformed) which did not show the ~ 86 Kd protein. This data confirmed tD- Partial purification of protein from transformed JM109 that producing Cry 1C toxin were done, solubilized and trypsinized with TPCK trypsin to produce the activated toxin (~65 kDa) and the rest of the 86 kDa was appeared at ~ 22 kDa.E- Western blotting showed that E. coli JM 109 produced a protein of approximately 86 kDa that cross reacted with poly clonal antisera raised against 60 kDa toxin from B. thuringiensis kur-HD-1. These confirmatory tests revealed the expression of the Cry 16- In this work ten bacterial isolates dwell in extreme habitats (high salt, high temperature, and low oxygen) were isolated and selected from a huge number of isolates. Six of these isolates were Bacillus thuringiensis that tolerate high salt concentratتتميز الكائنات الدقيقة التي تعيش في ظروف بيئية متطرف مثل الملوحة الشديدة او درجات الحرارة العالية باهميتها في مجال التكنولوجيا الحيوية لما تنتجة من مركبات و نواتج ايضية قادرة على تحمل الظروف شديدة التطرف, ولذا فلقد تزايد الاهتمام في الاونه الاخيرة بعزل و مع تزايد الاهتمام بالهندسة الوراثية والبيولوجيا الجزيئية حيث نتج عن ذلك العديد من التقنيات الحديثة بدأ بالبصمة البروتينية والوراثية واستنساخ الجينات في عوائل مختلفة, تحديد تتابعات النيوكليوتيدات بالجينات, بناء الخرائط الوراثية وانتهاء العمل خريطة شبة متكالذلك لقد استهدفت الدراسة الحالية عزل وتنقية عزلات بكتيرية مقاومة للملوحة الشديدة والحرارة العالية من الملاحات الشمسية ودراسة الخصائص الغير عادية لهذه العزلات والتي لها تطبيق في البيوتكنولوجي. كما استهدفت هذه الدراسة ايضا محاولة استخدام الهندسة الوراثية فيوتتلخص النتائج التي تم التوصل اليها فيما يلي:-1- تم جمع العينات التربه من الملاحات الشمسية من برج العرب وملاحات مريوط والعامرية والساحل الشمالي, ثم تحليلها فوجد ان الاملاح المذابة والكبريتات الذائبة والبيوكربونات كانت 18-24 جرام /لتر و 4.1 ملي جرام /100 جرام و 0.5 جرام/100 جرام على التوالي, بينما بلغ2- استخدم في عزل و تنقية البكتريا المقاومة للملوحةالشديدة والحرارة العالية منبت غذائي مكون من البيبتون ومستخلص الخميرة والمستخلص اللحمي ومحتوية ايضا على تركيزات من كلوريد الصوديوم المختلفة 0.5%, 10%, 15%, 20%, 22% & 24% و تم التحضين عند درجات حرارة مختلفه3- العينات المختبرة تحتوي على اعداد مختلفة من البكتريا المقاومة للملوحة الشديدة والحرارة العالية حيث ان اعلى عدد للوحدات المكونة للمستعمرات البكتيرية لوحظ في عينة الساحل الشمالي ((3.0x105في وجود 24% من تركيز كلوريد الصوديوم ودرجة تحضين 30 °م تتبعها عينة برج العرب وكانت ((3.0x102 تحت نفس الظروف وعلى الجانب الاخر اعلى عدد للوحدات المكونة للمستعمرات البكترية لوحظ في عينة برج العرب وكانت ((4.5x104 في وجود 10% من كلوريد الصوديوم والتحضين عند 74- كانت اكثر العزلات مقاومة للملوحة كانت عند تركيز 30% (5.2 مولر) من كلوريد الصوديوم واكثر العزلات مقاومة الحرارة العالية كانت 75 ° م قد تم اختبار عشرة عزلات لاجراء باقي التجارب عليها.5- تم عمل الوصف المورفولوجي للمستعمرات البكتيرية بعد انمائها على المنبت الغذائي المكون من الببيتون ومستخلص الخميرة والمستخلص اللحمي حيث ان الفحص تحت الميكروسكوب للعزلات البكترية يوضح انها من بكتريا موجبة الجرام ومكونة للجراثيم الداخلية, وتم تقسيم العزلات 6- امتدت الدراسة لتحديد الصفات الفسيولوجية والكيمائية للعزلات البكتيرية ووجد ان جميعها تنتمي بمجموعة البكتريا العصوية موجبة الجرام واختيارية النمو في الظروف الهوائية وفي غياب الاكسجين, وايجابية لانزيم الكتاليز واختزال النترات وموجبة مع تخمير السكريات. فال7- تم عمل تفاعل البلمرة التسلسلي العشوائي RAPD-PCR لاثبات اختلاف سلالات كل مجموعة حيث استخدم خمسة بادئات مختلفة للتفرقة بين العزلات لنفس المجموعة وهذه البادئات هي (OPA-11, (13, 15, 16 & 17 و OPC-17, 15, 16, 07& 17)).8- تم عمل الفصل الكهربي للبروتين المعزول من السلالات للمجموعة A ((Bacillus thuringiensis للخلايا المتجرثمة لدراسة التشابهة والاختلاف بين هذه العزلات حيث اظهرت النتائج ان الطرز البروتيني للخلايا مكونة بروتينات عالية ووزنها الجزيئي يتراوح بين 135-65 كيلودال9- تم عمل تفريد كهربي ايضا للبروتينات المعزولة من سلالات المجموعة B (Bacillus polymyxa) لتعيين الطرز البروتيني للخلايا وتم مقارنتها بسلالات اخرى معرفة دولية من سلالة polymyxa Bacillus لتاكيد التعريف حيث ان العزلات المحلية تتطابق بروتينيا مع هذه العزلات عن10- تم عمل الفصل الكهربي للبروتين المعزول من السلالات عند تركيزات متدرجة من الملوحة. فالنتائج اثبتت ظهور بعض البروتينات عند التركيزات العالية من الملح والتي وزنها الجزيئي حوالي 60 كيلودالتون و 30 كيلودالتون في العزلة 2 والبروتينات التي وزنها الجزيئي 95 كي11- استخدام تقنية تفاعل البلمرة التسلسلي PCR في معرفة المورثات (الجينات) المسئولة عن البروتين السام ( Cry 1C genes ) حيث تم اختيار 6 بادئات والتي تثبت وجود او عدم وجود هذه الجينات وهم CJ10&CJ11 والتي تعطي ناتج عند 130 زوج قاعدي و CJ1-1& CJ1-2 والتي تعطي ن12- استخدم كذلك تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل PCR في معرفة تواجد المورثات (الجينات) glnB و nif D والمسئولين عن تكوين ال PII بروتين وتثبيت النيتروجين في التربة على التوالي والتي يؤكد التعريف لسلالات الباسيلس بوليميكسا , وقد اظهرت النتائج وجود هذه الجينات حي13- تم كذلك دراسة قدرة هذه العزلات البكتيرية للسلالة Bacillus thuringiensis على قتل حشرة Spodoptera littoralis حيث اظهرت النتائج القدرة العالية لسلالة رقم 1 لقتل هذه الحشرة عند تركيز 200 جزء من المليون.14- تم استخدام احدى تقنيات الهندسة الوراثية لمحاولة كلونة جزء من الجين Cry1Cالموجودة في باسيلس ثورنجينسيس الذي يبلغ حوالي 2.2 كيلوزوج قاعدي وهذا الجزء عبارة عن الجين ومقطوع منه مجموعة الكربوكسيل ونقله الى بكتريا ايشريشياكولاي في وجود البلازميد T-Easy ®PGE15- تم عمل العديد من التجارب لتأكد من وجود هذا الجين داخل الايشرشياكولاي وهذه التجارب استخدم تفاعل البلمرة المتسلسل لمعرفة وجود الجين, استخدم انزيمات القطعEcoR1 & Not1, لقطع هذا الجين من داخل الناقل, استخدم التفريد الكهربي للبروتين الخاص بالبكتريا الحاملة16- مما سبق فانه يمكن استخدام سلالات الباسيلس ثورنجينسيس في مقاومة الحشرات بجانب مقاومتها للحرارة العالية والملوحة الشديدة كما ان سلالات مجموعة الباسيلس بوليميكسا فانها تستخدم في تثبيت النيتروجين بجانب مقاومتها للحرارة العالية للملوحة الشديدة.
|
|
|